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    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    日期:2012-01-17 11:11:35 瀏覽次數:995

    細胞體外培養用水中水的質量要求

    提起細胞體外培養實驗,每個經歷過的實驗者都會有這樣的領悟吧,

    細胞虐我千百遍,我待細胞如初戀。

    明明小心翼翼的操作,

    細胞總會莫名其妙的被污染了!

    莫名其妙的掛掉啦!

     rephile 樂楓 純水 過濾 默克 密理博 兼容 耗材

    到底怎么回事呢?

    其實造成細胞污染的因素不單單是微生物,培養環境中所摻雜的物質也可能會影響細胞的生長。水是細胞賴以生存的主要環境,營養物質和代謝產物都必須溶解在水中,才能為細胞吸收和排泄。對于體外培養的細胞來說,水是所有細胞培養液和試劑中簡單、但也是重要的組分。所以,細胞培養對水的質量要求較高,培養用水中如果含有一些雜質,即使含量極微,有時也會影響細胞的存活和生長,甚至導致細胞死亡。

    水中的雜質對水質有不同影響:

    1.離子——平衡滲透壓;一些重金屬 (Cadmium)對細胞毒害大,即便劑量很低 (< 0.1 ppb); 

    2.微生物——污染,改變微環境如pH,影響增殖,死后釋放內毒素等;

    3.內毒素——改變細胞外形、活化細胞、促進或抑制細胞分裂、影響細胞附著等;

    4.有機物——影響細胞的生長狀態。

    水質評價常用的指標:

    1. 電阻率(electrical resistivity)

    衡量實驗室用水導電性能的指標,單位為MΩ?cm,隨著水內無機離子的減少電阻數值逐漸變大。

    2. 異體菌落數(Heterotrophic bacteria count,HBC)

    衡量實驗室用水微生物的指標,單位為cfu/mL。

    3. 有機物(Total Organic Carbon ,TOC)

    水中碳的濃度,反映水中可氧化的有機化合物的含量,可間接反映出水中細菌和內毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。

    4. 內毒素(Endotoxin)

    革蘭氏陰性細菌的脂多糖細胞壁碎片,又稱之為“熱原”,單位EU/mL。


    參考國際標準化組織的實驗室純水規范ISO3696,美國CLSI和ASTM D1193的試劑純水規范,我國GBT6682和GBT 30301的試驗用水指導,《實驗細胞資源的描述標準與管理規范》用水指導,結合多年的實驗操作經驗,總結出細胞培養用水對水質的要求。


    細胞培養對水質的要求:

    1.一定要無菌:HBC < 0.01 cfu/mL

    2.無蛋白及核酸酶和內毒素:無內毒素或無熱源<0.03EU/mL

    3.阻礙細胞生長的有機物含量要低:TOC <5 ppb

    4.去除離子含量:電阻率≥18 MΩ?cm(@25℃)


    細胞體外培養用水中純水機的配置要求


    細胞培養過程中,各種培養液和試劑的配制用水均需要經過嚴格的純化處理,不含離子和其他的雜質,即使是儲存試劑的玻璃器皿,在自來水沖洗過后也應用超純水漂洗三次以上。目前,市場上供應的純水裝置種類較多,比如自來水進水同時制備二級純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置,可以由自來水進水通過預處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI(連續電流電去離子)模塊等純化后達到二級純水,儲存于水箱中以滿足日常的清洗應用;水箱中的水再經過U Pack超純化柱去離子,紫外燈照射殺菌并降低有機物含量,最后經終端濾器RephiBio過濾,以獲得無菌、無熱源、無核酸酶的超純水。


    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    Genie G 水路圖


    要想達到細胞培養用水的水質要求,純水機的配置很關鍵,帶有消毒模塊的純水水箱、終端過濾器、取水水質的實時監測等配置都關系著產水水質是否達標。

    純水的儲存對保持純水的質量是至關重要的,由于周圍環境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH,所以儲存水的容器要盡量密封,避免和外界過多接觸,抑制微生物生長。如Genie純水設備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器,能夠盡可能的保證水箱內的純水水質。


    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    水箱空氣過濾器(含CO2吸附劑) 200/350L 水箱空氣過濾器

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    主控屏顯示水箱水循環狀態


    終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物,滿足不同實驗的應用需求。對于細胞體外培養可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器,安裝在樂楓超純水系統的出水口,可有效去除水中的熱原(內毒素)、核酸酶、細菌等雜質,制備符合細胞培養用水要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌)。


    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!


    對于超純水而言需要格外注意終端水質的TOC、電阻率、細菌和內毒素的含量,必須做到即取即用,因此取水的遠程監控和水質實時監測就顯得尤為重要。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的 實驗室純水 (如上面提到的Genie),將水機和取水手柄分別放在潔凈間的內外,通過無線控制取水手柄達到超純水的取用和實時檢測水的電阻率和TOC數值,適合無菌環境下的操作,盡可能減少污染。


    無線 · 自由 細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!
    • 局域網無線通信技術 

    • 各單元擺脫信號線羈絆

    • 主機,主控屏,手柄擺放可自由組合 


    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    手柄觸屏信息


    ? 系統運行狀態:待機,泄壓,循環,產水

    ? 水箱液位:0%或者L

    ? 純水(超純水)水質參數:電阻率、TOC、溫度

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!   

     終 端 水 質


                     實 時 監 測


    結合上述用水要求,為大家介紹兩款制備超純水的水機,Genie G一體化純水儀Genie PURIST 超純水儀。

     

    Genie G一體化純水儀

    以自來水為進水制備超純水和 EDI 二級純水

    性能指標

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    Genie PURIST 超純水儀

    以純水(EDI 純水,RO 水或蒸餾水等)為進水,制備實驗室超純水。

    性能指標

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!

    細胞體外培養實驗的成功要從用水的選擇開始!


    【注意事項】

    1.超純水應當注意使用時間,應該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質導致水質下降。

    2.在合適的環境使用超純水。環境中的VOC(揮發性有機物),細菌等都會影響細胞培養。

    3.培養細胞的容器應當潔凈無污染。 

    4.配制離散細胞用的消化液和細胞洗滌液時,宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液,緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機,避免鈣、鎂離子促使細胞凝聚作用的產生。


    不同細胞體外培養用水選擇指南


    細胞培養(cell culture)是指在體外模擬體內環境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養的整個流程中實驗用水貫穿每一個環節:


    1.取材:組織的清洗和灌注試劑用水,如PBS緩沖液、Hanks液的配制;

    2.原代培養:1640、DMEM等培養基用水,明膠等支持物的配制,添加藥物、檢測試劑的配制;

    3.傳代培養:胰酶等消化液的配制;

    4.凍存:細胞凍存液DMSO的配制。


    細胞體外培養的細胞類型一般分為動物細胞培養、植物細胞培養和微生物培養,其中最難的是動物細胞的培養。動物細胞的培養除了需要無菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件,它還需要血清、支持物等特殊物質,其中原代細胞的培養是最難的。植物細胞的培養需要光照和激素,而且培養條件和培養技術比較成熟。微生物培養多為單細胞生物,微生物人工培養的條件比動植物細胞簡單得多,蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養基即可滿足微生物的營養要求,其中厭氧微生物培養比好氧微生物復雜,需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。


    由于細胞的種類和培養條件不同,對培養環境中雜質的含量要求也不同,那么配制培養基或試劑用水的選擇大有講究,不同細胞體外培養用水的指標如下:


    細胞體外培養用水選擇

    細胞類型 純水等級 電阻(MΩ?cm)

    TOC(ppb)

    微生物(cfu/mL)

    內毒素(Eu/mL)

    核酸酶(pg/mL)

    動物細胞 超純水

    >18

    <10

    <1

    <0.002?

    ND

    植物細胞 超純水

    >18

    <10

    <1

    <0.002?

    ND

    微生物 實驗室Ⅱ級純水

    >10

    <50

    <1

    NA

    NA


    從上表可以看出,動物細胞和植物細胞的培養對去除內毒素和核酸酶的要求很高,用于這兩類細胞培養可以選擇商品化的細胞培養用水,另外去除純水中的內毒素和核酸酶可以通過在純水機的取水口安裝終端濾器達到。


    各種細胞培養用水的比較

    細胞培養用水

    制備方法

    優點

    缺點

    商品化細胞培養用水

    純水或超純水進行多效蒸餾制成,嚴格控制熱源、無菌、內毒素、pH、滲透壓等指標

    水質標準程度化高,可保證實驗結果的重復性

    價格昂貴

    DEPC水

    DEPC處理過并經高溫高壓滅菌的MiliQ純水,無RNase、DNAase和proteinase。

    完全去除核酸酶

    價格昂貴,未去除內毒素

    終端濾器過濾純水

    采用0.22μm的過濾膜,可有效去除水中的熱原(內毒素)、核酸酶、細菌等雜質。

    性價比高,供水量大

    對取水環境要求高


    樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22μm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜,可制備符合生物領域應用要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌),純水中內毒素含量低于0.001 Eu/mL,核酸酶的含量低于可檢測范圍,微生物的含量低于0.1 cfu/mL,可以滿足動物細胞和植物細胞的需求。

    Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個月,以達到好的使用效果。

     

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